Kitt ta 'Mutaġenesi Mgħaġġel Dirett mis-Sit

Mudell A-1

■ Il-mudell fih impuritajiet tal-proteini jew inibituri tat-Taq, eċċ. ——Purifika l-mudell tad-DNA, neħħi l-impuritajiet tal-proteini jew estratt il-mudell tad-DNA bil-kitts tal-purifikazzjoni.

■ Id-denaturazzjoni tal-mudell mhix kompluta —— Żid b'mod xieraq it-temperatura tad-denaturazzjoni u ittawwal il-ħin tad-denaturazzjoni.

■ Degradazzjoni tal-mudell —— Ipprepara mill-ġdid il-mudell.

A-2 Primer

■ Kwalità fqira ta 'primers —— Re-sintetizza l-primer.

■ Primer degradazzjoni ——Aliquot il-primers ta 'konċentrazzjoni għolja f'volum żgħir għall-preservazzjoni. Evita l-iffriżar u t-tidwib multipli jew il-krijo-preservazzjoni ta '4 ° C fit-tul.

■ Disinn mhux xieraq tal-primers (eż. It-tul tal-primer mhux biżżejjed, dimer iffurmat bejn il-primers, eċċ.) - Primers mill-ġdid (evita l-formazzjoni tad-dimer tal-primer u l-istruttura sekondarja)

A-3 Mg²⁺konċentrazzjoni

■ Mg²⁺ il-konċentrazzjoni hija baxxa wisq —— Żid sewwa Mg²⁺ konċentrazzjoni: Ottimizza l-Mg²⁺ konċentrazzjoni minn serje ta 'reazzjonijiet minn 1 mM sa 3 mM b'intervall ta' 0.5 mM biex tiddetermina l-aħjar Mg²⁺ konċentrazzjoni għal kull mudell u primer.

A-4 Temperatura tat-tkessiħ

■ It-temperatura għolja ta 'l-ittemprar taffettwa l-irbit tal-primer u l-mudell. —— Naqqas it-temperatura ta 'l-ittemprar u ittejjeb il-kundizzjoni bi gradjent ta' 2 ° C.

A-5 Ħin ta 'estensjoni

■ Ħin qasir ta 'estensjoni —— Żid il-ħin ta' estensjoni.

Fenomeni: Kampjuni negattivi juru wkoll il-meded tas-sekwenza fil-mira.

A-1 Kontaminazzjoni ta 'PCR

■ Kontaminazzjoni inkroċjata tas-sekwenza ta 'mira jew prodotti ta' amplifikazzjoni ——B'attenzjoni biex ma tippipepjax il-kampjun li fih is-sekwenza ta 'mira fil-kampjun negattiv jew tixridhom mit-tubu taċ-ċentrifuga. Ir-reaġenti jew it-tagħmir għandhom ikunu awtoklavati biex jeliminaw l-aċidi nuklejċi eżistenti, u l-eżistenza ta ’kontaminazzjoni għandha tiġi ddeterminata permezz ta’ esperimenti ta ’kontroll negattiv.

■ Kontaminazzjoni tar-reaġent ——Aliquot ir-reaġenti u aħżen f'temperatura baxxa.

A-2 Primr

■ Mg²⁺ il-konċentrazzjoni hija baxxa wisq —— Żid sewwa Mg²⁺ konċentrazzjoni: Ottimizza l-Mg²⁺ konċentrazzjoni minn serje ta 'reazzjonijiet minn 1 mM sa 3 mM b'intervall ta' 0.5 mM biex tiddetermina l-aħjar Mg²⁺ konċentrazzjoni għal kull mudell u primer.

■ Disinn mhux xieraq tal-primer, u s-sekwenza fil-mira għandha omoloġija mas-sekwenza mhux fil-mira. —— Primers tad-disinn mill-ġdid.

Fenomeni: Il-meded ta 'amplifikazzjoni tal-PCR huma inkonsistenti mad-daqs mistenni, kemm jekk kbir jew żgħir, jew kultant iseħħu kemm meded ta' amplifikazzjoni speċifiċi kif ukoll meded ta 'amplifikazzjoni mhux speċifiċi.

A-1 Primer

■ Speċifiċità fqira tal-primer

—— Primer tad-disinn mill-ġdid.

■ Il-konċentrazzjoni tal-primer hija għolja wisq —— Żid sew it-temperatura ta 'denaturazzjoni u ittawwal il-ħin ta' denaturazzjoni.

A-2 Mg²⁺ konċentrazzjoni

■ Il-Mg²⁺ il-konċentrazzjoni hija għolja wisq —— Naqqas sew il-konċentrazzjoni ta 'Mg2 +: Ittejjeb l-Mg²⁺ konċentrazzjoni minn serje ta 'reazzjonijiet minn 1 mM sa 3 mM b'intervall ta' 0.5 mM biex tiddetermina l-aħjar Mg²⁺ konċentrazzjoni għal kull mudell u primer.

A-3 Polimerasi termostabbli

■ Ammont eċċessiv ta 'enżima —— Naqqas l-ammont ta' enżima b'mod xieraq f'intervalli ta '0.5 U.

A-4 Temperatura tat-tkessiħ

■ It-temperatura ta 'l-ittemprar hija baxxa wisq —— Żid b'mod xieraq it-temperatura ta' l-ittemprar jew tadotta l-metodu ta 'l-ittemprar f'żewġ stadji

A-5 ċikli PCR

■ Wisq ċikli PCR —— Naqqas in-numru ta 'ċikli PCR.

A-1 Primer——Speċifiċità fqira —— Iddisinja mill-ġdid il-primer, ibdel il-pożizzjoni u t-tul tal-primer biex ittejjeb l-ispeċifiċità tagħha; jew wettaq PCR imqabbad.

A-2 Template DNA

——Il-mudell mhuwiex pur ——Purifika l-mudell jew estratt tad-DNA bi kitts ta 'purifikazzjoni.

A-3 Mg²⁺ konċentrazzjoni

——Mg²⁺ il-konċentrazzjoni hija għolja wisq —— Naqqas sew Mg²⁺ konċentrazzjoni: Ottimizza l-Mg²⁺ konċentrazzjoni minn serje ta 'reazzjonijiet minn 1 mM sa 3 mM b'intervall ta' 0.5 mM biex tiddetermina l-aħjar Mg²⁺ konċentrazzjoni għal kull mudell u primer.

A-4 dNTP

——Il-konċentrazzjoni ta ’dNTPs hija għolja wisq —— Naqqas il-konċentrazzjoni ta’ dNTP b’mod xieraq

A-5 Temperatura ta 'l-ittemprar

——Temperatura baxxa wisq ta 'l-ittemprar —— Żid b'mod xieraq it-temperatura ta' l-ittemprar

Ċikli A-6

—— Ħafna ċikli ——Ottimizza n-numru taċ-ċiklu

L-ewwel pass huwa li tagħżel il-polimerasa xierqa. Taq polimerasi regolari ma jistax jaqra l-provi minħabba nuqqas ta 'attività ta' exonuclease ta '3'-5', u nuqqas ta 'qbil se jnaqqas ħafna l-effiċjenza ta' estensjoni ta 'frammenti. Għalhekk, il-polimerażi regolari Taq ma tistax effettivament tkabbar frammenti fil-mira akbar minn 5 kb. Taq polimerasa b'modifika speċjali jew polimerasa oħra ta 'fedeltà għolja għandha tintgħażel biex ittejjeb l-effiċjenza ta' l-estensjoni u tissodisfa l-ħtiġijiet ta 'amplifikazzjoni ta' framment twil. Barra minn hekk, l-amplifikazzjoni ta 'frammenti twal teħtieġ ukoll aġġustament korrispondenti tad-disinn tal-primer, ħin ta' denaturazzjoni, ħin ta 'estensjoni, buffer pH, eċċ. Normalment, primers bi 18-24 bp jistgħu jwasslu għal rendiment aħjar. Sabiex tiġi evitata ħsara fil-mudell, il-ħin ta 'denaturazzjoni f'94 ° C għandu jitnaqqas għal 30 sek jew inqas kull ċiklu, u l-ħin biex titla' t-temperatura għal 94 ° C qabel l-amplifikazzjoni għandu jkun inqas minn 1 min. Barra minn hekk, l-issettjar tat-temperatura tal-estensjoni għal madwar 68 ° C u d-disinn tal-ħin tal-estensjoni skont ir-rata ta '1 kb / min jista' jiżgura amplifikazzjoni effettiva ta 'frammenti twal.

Ir-rata ta 'żball ta' amplifikazzjoni tal-PCR tista 'titnaqqas billi jintużaw diversi DNA polimerasi b'fedeltà għolja. Fost il-polimerażi tad-DNA Taq misjuba s'issa, l-enżima Pfu għandha l-inqas rata ta 'żball u l-ogħla fedeltà (ara t-tabella mehmuża). Minbarra l-għażla tal-enżimi, ir-riċerkaturi jistgħu jnaqqsu aktar ir-rata ta ’mutazzjoni tal-PCR billi jottimizzaw il-kundizzjonijiet tar-reazzjoni, inkluż l-ottimizzazzjoni tal-kompożizzjoni tal-buffer, il-konċentrazzjoni tal-polimerasa termostabbli u l-ottimizzazzjoni tan-numru taċ-ċiklu tal-PCR.