TIANSeq DNA Quantification Kit (Illumina)

Fil-preżent, it-teknoloġija tas-sekwenzar ta 'produzzjoni għolja hija bbażata prinċipalment fuq it-teknoloġija tas-sekwenzar tal-ġenerazzjoni li jmiss. Peress li t-tul tal-qari tat-teknoloġija tas-sekwenzar tal-ġenerazzjoni li jmiss huwa limitat, irridu nkissru s-sekwenza tat-tul sħiħ f’libreriji żgħar tal-frammenti biex nissekwenu. Skond il-bżonnijiet ta 'esperimenti ta' sekwenzar differenti, ġeneralment nagħżlu sekwenzar ta 'tarf wieħed jew sekwenzar ta' tarf doppju. Bħalissa l-frammenti tad-DNA tal-librerija tas-sekwenzar tal-ġenerazzjoni li jmiss ġeneralment jitqassmu fil-medda ta '200-800 bp.

a) Id-DNA huwa fqir fil-kwalità u fih inibituri. Uża kampjuni ta 'DNA ta' kwalità għolja biex tevita l-inibizzjoni ta 'attività ta' enżimi.

b) L-ammont ta 'kampjun tad-DNA mhuwiex biżżejjed meta jintuża metodu mingħajr PCR biex tinbena librerija tad-DNA. Meta l-input tad-DNA frammentat jaqbeż il-50 ng, il-fluss tax-xogħol mingħajr PCR jista 'jitwettaq b'mod selettiv matul il-proċess tal-kostruzzjoni tal-librerija. Jekk in-numru tal-kopja tal-librerija huwa baxx wisq biex jiġi sekwenzat direttament, il-librerija tad-DNA tista 'tiġi amplifikata permezz ta' PCR wara l-ligation tal-adapter.

c) Il-kontaminazzjoni tal-RNA twassal għal kwantifikazzjoni inizjali tad-DNA mhux eżatta Il-kontaminazzjoni tal-RNA tista 'teżisti fil-proċess ta' purifikazzjoni tad-DNA ġenomika, li tista 'twassal għal kwantifikazzjoni tad-DNA mhux eżatta u tagħbija insuffiċjenti tad-DNA waqt il-kostruzzjoni tal-librerija. L-RNA jista 'jitneħħa billi jittratta b'RNase.

A-1

a) Frammenti żgħar (60 bp-120 bp) jidhru Frammenti żgħar huma ġeneralment frammenti ta 'adapter jew dimers iffurmati minn adapters. Il-purifikazzjoni b'żibeġ manjetiku Agencourt AMPure XP tista 'effettivament tneħħi dawn il-frammenti tal-adapter u tiżgura l-kwalità tas-sekwenzar.

b) Frammenti kbar jidhru fil-librerija wara l-amplifikazzjoni tal-PCR Id-daqs tal-framment tad-DNA tal-librerija jiżdied b'120 bp wara li l-adapter ikun ligat. Jekk il-framment tad-DNA jiżdied b'aktar minn 120 bp wara l-ligation tal-adapter, jista 'jkun ikkawżat minn amplifikazzjoni anormali tal-framment ta' amplifikazzjoni PCR eċċessiva. It-tnaqqis tan-numru ta 'ċikli tal-PCR jista' jipprevjeni s-sitwazzjoni.

c) Daqs mhux normali tal-frammenti tad-DNA tal-librerija wara l-ligation tal-adapter It-tul tal-adapter f'dan il-kit huwa 60 bp. Meta ż-żewġt itruf tal-framment jintrabtu mal-adapters, it-tul jiżdied biss b'120 bp. Meta tuża adapter għajr dak ipprovdut minn dan il-kit, jekk jogħġbok ikkuntattja lill-fornitur biex tipprovdi informazzjoni rilevanti bħat-tul tal-adapter. Jekk jogħġbok kun żgur li l-fluss tax-xogħol tal-esperiment u l-operazzjoni jsegwu l-passi deskritti fil-manwal.

d) Daqs anormali tal-framment tad-DNA qabel il-ligation tal-adapter Ir-raġuni għal din il-problema tista 'tkun ikkawżata minn kundizzjonijiet ta' reazzjoni ħażina waqt il-frammentazzjoni tad-DNA. Ħinijiet ta 'reazzjoni differenti għandhom jintużaw għal input ta' DNA differenti. Jekk id-dħul tad-DNA huwa aktar minn 10 ng, nirrakkomandaw li tagħżel il-ħin ta 'reazzjoni ta' 12 min bħala l-ħin tal-bidu għall-ottimizzazzjoni, u d-daqs tal-framment prodott f'dan il-ħin huwa prinċipalment fil-medda ta '300-500 bp. L-utenti jistgħu jżidu jew inaqqsu t-tul tal-frammenti tad-DNA għal 2-4 min skont ir-rekwiżiti tagħhom stess biex itejbu l-frammenti tad-DNA bid-daqs meħtieġ.

A-2

a) Il-ħin tal-frammentazzjoni mhuwiex ottimizzat Jekk id-DNA frammentat huwa żgħir wisq jew kbir wisq, jekk jogħġbok irreferi għall-Linji Gwida għall-Għażla tal-Ħin tal-Frammentazzjoni pprovduti fl-istruzzjoni biex tiddetermina l-ħin tar-reazzjoni, u uża dan il-punt tal-ħin bħala kontroll, issettja wkoll sistema ta 'reazzjoni biex ittawwal jew tqassar 3 min biex tagħmel aġġustament aktar preċiż fil-ħin tal-frammentazzjoni.

A-3

Distribuzzjoni mhux normali tad-daqs tad-DNA wara trattament ta 'frammentazzjoni

a) Metodu ta 'tidwib mhux korrett tar-reaġent tal-frammentazzjoni, jew ir-reaġent mhux imħallat kompletament wara li jinħall. Ħoll ir-reaġent tat-Taħlita tal-Enżimi tal-Frammentazzjoni 5 × fuq is-silġ. Ladarba jkun imdewweb, ħallat ir-reaġent indaqs billi ttella 'bil-mod il-qiegħ tat-tubu. Tħawwadx ir-reaġent!

b) Il-kampjun tad-dħul tad-DNA fih EDTA jew inkwinanti oħra It-tnaqqis ta 'joni tal-melħ u aġenti kelanti fil-pass tal-purifikazzjoni tad-DNA huwa partikolarment importanti għas-suċċess tal-esperiment. Jekk id-DNA tinħall f'1 × TE, uża l-metodu provdut fl-istruzzjoni biex twettaq frammentazzjoni. Jekk il-konċentrazzjoni EDTA fis-soluzzjoni hija inċerta, huwa rrakkomandat li d-DNA jiġi ppurifikat u dewweb f'ilma dejonizzat għal reazzjoni sussegwenti.

c) Kwantifikazzjoni tad-DNA inizjali mhux eżatta Id-daqs tad-DNA frammentat huwa relatat mill-qrib mal-ammont ta 'input tad-DNA. Qabel it-trattament tal-frammentazzjoni, kwantifikazzjoni preċiża tad-DNA bl-użu ta 'Qubit, Picogreen u metodi oħra hija essenzjali biex jiġi ddeterminat l-ammont eżatt ta' DNA fis-sistema ta 'reazzjoni.

 d) Il-preparazzjoni tas-sistema ta 'reazzjoni ma ssegwix l-istruzzjoni Il-preparazzjoni ta' sistema ta 'reazzjoni frammentata għandha ssir fuq silġ strettament skond l-istruzzjonijiet. Biex jiġi żgurat l-aħjar effett, il-komponenti kollha tar-reazzjoni għandhom jitpoġġew fuq is-silġ u l-preparazzjoni tas-sistema tar-reazzjoni għandha ssir wara li tkessaħ kompletament. Wara li l-preparazzjoni tkun tlestiet, jekk jogħġbok flick jew pipet biex tħallat sewwa. M'għandekx vortex!

1. Metodu ta 'taħlit mhux xieraq (vortex, oxxillazzjoni vjolenti, eċċ.) Jikkawża distribuzzjoni anormali ta' frammenti tal-librerija (kif muri fil-figura li ġejja), u b'hekk taffettwa l-kwalità tal-librerija. Għalhekk, meta tipprepara s-soluzzjoni tar-reazzjoni tat-Taħlita tal-Frammentazzjoni, jekk jogħġbok ippipetta bil-mod 'il fuq u' l isfel biex tħallat, jew uża t-tarf tas-swaba 'biex tteptep u ħawwad indaqs. Oqgħod attent li ma tħallatx ma 'vortex.

2. DNA ta 'purità għolja għandu jintuża għall-kostruzzjoni tal-librerija

■ Integrità tajba tad-DNA: Il-faxxa tal-elettroforeżi hija aktar minn 30 kb, mingħajr tailing

■ OD260 / 230:> 1.5

■ OD260 / 280: 1.7-1.9

3. L-ammont ta 'input tad-DNA għandu jkun preċiż Huwa ssuġġerit li jintużaw metodi Qubit u PicoGreen biex jikkwantifikaw id-DNA, aktar milli Nanodrop.

4. Il-kontenut ta 'EDTA f'soluzzjoni tad-DNA għandu jkun determinat EDTA għandu influwenza kbira fuq ir-reazzjoni ta' frammentazzjoni. Jekk il-kontenut ta 'EDTA huwa għoli, il-purifikazzjoni tad-DNA trid issir qabel it-test sussegwenti.

5. Is-soluzzjoni tar-reazzjoni tal-frammentazzjoni għandha tkun ippreparata fuq is-silġ Il-proċess tal-frammentazzjoni huwa sensittiv għat-temperatura u l-ħin tar-reazzjoni (speċjalment wara li żżid it-tisħiħ). Sabiex tkun żgurata l-eżattezza tal-ħin tar-reazzjoni, jekk jogħġbok ipprepara sistema ta 'reazzjoni fuq is-silġ.

6. Il-ħin tar-reazzjoni tal-frammentazzjoni għandu jkun preċiż Il-ħin tar-reazzjoni tal-pass tal-frammentazzjoni jaffettwa direttament id-daqs tal-prodotti tal-framment, u b'hekk jaffettwa d-distribuzzjoni tad-daqs tal-frammenti tad-DNA fil-librerija.

1. X'tip ta 'kampjun huwa applikabbli għal dan il-kit?

It-tip ta 'kampjun applikabbli ta' dan il-kit jista 'jkun RNA totali jew mRNA purifikat b'integrità tajba ta' RNA. Jekk RNA totali tintuża biex tibni l-librerija, huwa rrakkomandat li tuża l-kit ta 'tnaqqis ta' rRNA (Cat # 4992363/4992364/4992391) biex tneħħi l-ewwel rRNA.

2. Jistgħu jintużaw kampjuni FFPE biex tinbena librerija b'dan il-kit?

L-mRNA fil-kampjuni FFPE se jkun degradat sa ċertu punt, b'integrità relattivament fqira. Meta tuża dan il-kit għall-kostruzzjoni tal-librerija, huwa rrakkomandat li jiġi ottimizzat il-ħin tal-frammentazzjoni (tqassar il-ħin tal-frammentazzjoni jew ma tagħmilx frammentazzjoni).

3. Bl-użu tal-pass tal-għażla tad-daqs ipprovdut fil-manwal tal-prodott, x'jista 'jikkawża li s-segment imdaħħal jidher devjazzjoni żgħira?

L-għażla tad-daqs għandha titwettaq f'konformità stretta mal-pass tal-għażla tad-daqs f'dan il-manwal tal-prodott. Jekk hemm devjazzjoni, ir-raġuni tista 'tkun li ż-żibeġ manjetiċi mhumiex ibbilanċjati għat-temperatura tal-kamra jew mhumiex imħallta għal kollox, il-pipetta mhix preċiża jew il-likwidu jibqa' fit-tarf. Huwa rrakkomandat li tuża l-ponot b'assorbiment baxx għall-esperiment.

4. Għażla ta 'adapters fil-kostruzzjoni tal-librerija

Il-kit tal-kostruzzjoni tal-librerija ma fihx reaġent tal-adapter, u huwa rrakkomandat li tuża dan il-kit flimkien ma 'TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC tal-librerija

Sejbien kwantitattiv tal-librerija: Qubit u qPCR jintużaw biex jiddeterminaw il-konċentrazzjoni tal-massa u l-konċentrazzjoni molari tal-librerija rispettivament. L-operazzjoni hija strettament skond il-manwal tal-prodott. Il-konċentrazzjoni tal-librerija ġeneralment tissodisfa r-rekwiżiti tas-sekwenzar NGS. Sejbien tal-firxa tad-distribuzzjoni tal-librerija: Uża Agilent 2100 Bioanalyzer biex tiskopri l-firxa tad-distribuzzjoni tal-librerija.

6. Għażla tan-numru taċ-ċiklu ta 'amplifikazzjoni

Skond l-istruzzjonijiet, in-numru ta 'ċikli ta' PCR huwa 6-12, u n-numru ta 'ċikli ta' PCR meħtieġa għandu jintgħażel skond l-input tal-kampjun. Fil-libreriji ta ’rendiment għoli, l-amplifikazzjoni żejda ġeneralment isseħħ fi gradi differenti, li tidher minn quċċata kemmxejn akbar wara l-quċċata tal-firxa fil-mira fis-sejbien ta’ Agilent 2100 Bioanalyzer, jew il-konċentrazzjoni misjuba ta ’Qubit hija inqas minn dik ta’ qPCR. Amplifikazzjoni ħafifa fuq hija fenomenu normali, li ma jaffettwax is-sekwenzar tal-librerija u l-analiżi sussegwenti tad-dejta.

7. Spikes jidhru fil-profil ta 'skoperta ta' Agilent 2100 Bioanalyzer

Id-dehra ta 'spikes fis-sejbien ta' Bioanalyzer Agilent 2100 hija minħabba l-frammentazzjoni irregolari tal-kampjuni, fejn se jkun hemm aktar frammenti f'ċertu daqs, u dan isir aktar ovvju wara l-arrikkiment tal-PCR. F'dan il-każ, huwa ssuġġerit li ma titwettaqx l-għażla tad-daqs, jiġifieri ssettja l-kundizzjoni tal-frammentazzjoni għal 94 ° C għal 15 min inkubat, fejn id-distribuzzjoni tal-framment hija żgħira u kkonċentrata, u l-omoġeneità tista 'titjieb.