FastKing RT Kit (Bil-gDNase)

A-1 RNA huwa degradat

——Purifika RNA ta 'kwalità għolja mingħajr kontaminazzjoni. Il-materjal li minnu jiġi estratt l-RNA għandu jkun kemm jista 'jkun frisk biex jipprevjeni d-degradazzjoni tal-RNA. Analizza l-integrità ta 'l-RNA fuq ġel żnaturat qabel ir-reazzjoni RT. Wara l-estrazzjoni tal-RNA, għandu jinħażen f'100% formamide. Jekk jintuża inibitur tar-RNase, it-temperatura tat-tisħin għandha tkun <45 ° C, u l-pH għandu jkun inqas minn 8.0, inkella l-inibitur jirrilaxxa r-RNase kollha marbuta. Barra minn hekk, inibitur ta 'RNase għandu jiżdied f'soluzzjonijiet li jkun fihom ≥ 0.8 mM DTT.

A-2 RNA fih inibituri ta 'reazzjonijiet ta' traskrizzjoni inversa

—— Inibituri tat-traskrizzjoni inversa jinkludu SDS, EDTA, gliċerol, pirofosfat tas-sodju, spermidina, formamida, melħ tal-gwanidina, eċċ Ħallat l-RNA tal-kontroll mal-kampjun, u qabbel ir-rendiment mar-reazzjoni tal-kontroll RNA biex tivverifika jekk hemmx inibitur. Aħsel il-preċipitazzjoni ta 'l-RNA b'70% (v / v) etanol biex tneħħi l-inibituri.

A-3 Ittemprar insuffiċjenti ta 'primers użati għas-sintesi ta' l-ewwel linja ta 'cDNA

—— Iddetermina li t-temperatura ta 'l-ittemprar hija adattata għall-primers użati fl-esperiment. Għal eżameri każwali, huwa rrakkomandat li żżomm it-temperatura f'25 ° C għal 10 min qabel ma tilħaq it-temperatura tar-reazzjoni. Għal primers speċifiċi għall-ġeni (GSP), ipprova GSP ieħor, jew aqleb għal oligo (dT) jew hexamer każwali.

A-4 Ammont żgħir ta 'RNA tal-bidu

—— Żid l-ammont ta 'RNA. Għal kampjuni ta 'RNA inqas minn 50 ng, 0.1 μg sa 0.5 μg acetyl BSA jistgħu jintużaw fl-ewwel sintesi ta' cDNA strand

A-5 Is-sekwenza fil-mira mhix espressa fit-tessuti analizzati.

—— Ipprova tessuti oħra.

Reazzjoni A-6 PCR tfalli

——Għal RT-PCR f'żewġ stadji, il-mudell cDNA fil-pass PCR ma jistax jaqbeż 1/5 tal-volum tar-reazzjoni.

A-1 Ittemprar mhux speċifiku ta 'primers u mudelli

—— It-tarf 3'tal-primers m'għandux ikun fih 2-3 dG jew dC. Uża primers speċifiċi għall-ġeni fl-ewwel sintesi tal-korda minflok primers jew oligo każwali (dT). Uża temperatura ta 'ttemprar ogħla fl-ewwel ftit ċikli, u mbagħad temperatura ta' ttemprar aktar baxxa. Uża hot-start Taq DNA polymerase għal PCR biex ittejjeb l-ispeċifiċità tar-reazzjoni.

A-2 Disinn fqir ta 'primers speċifiċi għall-ġeni

—— Segwi l-istess prinċipji għad-disinn tal-primer tal-amplifikazzjoni.

A-3 RNA kkontaminat b'DNA ġenomika

—— Ittratta l-RNA b'DNase ta 'grad PCR I. Issettja reazzjoni ta' kontroll mingħajr traskrizzjoni inversa biex tiskopri kontaminazzjoni tad-DNA.

A-4 Formazzjoni ta 'primer dimer

—— Iddisinja primers mingħajr sekwenzi komplementari fit-tarf 3 '.

A-5 Mg għoli wisq²⁺ konċentrazzjoni

——Optimize Mg²⁺ konċentrazzjoni għal kull mudell u kombinazzjoni ta 'primer

A-6 Kontaminat b'ADN barrani

—— Uża ponot reżistenti għall-ajrusol u enżimi UDG.

A-1 Il-kontenut tal-ewwel prodott tal-linja huwa għoli wisq

—— Naqqas l-ammont tal-ewwel prodott tal-linja fil-pass ta 'reazzjoni konvenzjonali tal-PCR.

A-2 Ammont għoli wisq ta 'primer f'reazzjoni ta' PCR

—— Naqqas l-input tal-primer.

A-3 Wisq ċikli

——Ottimizza l-kundizzjonijiet tar-reazzjoni tal-PCR u naqqas in-numru taċ-ċiklu tal-PCR.

A-4 Temperatura baxxa wisq ta 'l-ittemprar

—— Żid it-temperatura tal-ittemprar biex tevita bidu u estensjoni mhux speċifiċi.

A-5 Amplifikazzjoni mhux speċifika ta 'frammenti oligonukleotidi ġġenerati mid-degradazzjoni tad-DNA tad-DNA —— Estratt RNA ta' kwalità għolja biex tevita l-kontaminazzjoni tad-DNA.

RT-PCR huwa li jirriversja t-traskrizzjoni ta 'RNA f'cDNA, u mbagħad uża t-traskritt ta' cDNA bħala mudell għar-reazzjoni tal-PCR biex jamplifika l-framment fil-mira. Agħżel jew primers każwali, Oligo dT u primers speċifiċi għall-ġeni skond il-kondizzjonijiet speċifiċi ta 'l-esperiment. Il-primers kollha ta 'hawn fuq jistgħu jintużaw għal mRNA ta' ċellula ewkarjotika qasira mingħajr struttura ta 'hairpin.

Primer każwali: Adattat għal RNA twil bi struttura ta 'pinnijiet tax-xagħar, kif ukoll għal kull tip ta' RNA bħal rRNA, mRNA, tRNA, eċċ. Dawn jintużaw prinċipalment għal reazzjoni RT-PCR ta 'mudell wieħed.

Oligo dT: Adattat għall-RNA bit-tailing PolyA (RNA prokariotika, Oligo dT rRNA ewkarjotika u tRNA m'għandhomx denb PolyA). Minħabba li Oligo dT huwa marbut ma 'denb PolyA, il-kwalità tal-kampjuni ta' RNA hija meħtieġa li tkun għolja, u anke ammont żgħir ta 'degradazzjoni se jnaqqas ħafna l-ammont ta' sinteżi ta 'cDNA ta' tul sħiħ.

Primer speċifiku għall-ġeni: Kumplimentari għas-sekwenza tal-mudell, adattat għal sitwazzjonijiet fejn is-sekwenza fil-mira hija magħrufa.

Hemm żewġ modi:

1. Metodu ta 'referenza interna: Fit-teorija, cDNA huma frammenti ta' DNA ta 'tulijiet differenti, għalhekk ir-riżultat tal-elettroforeżi huwa smear. Jekk l-abbundanza ta 'l-RNA hija baxxa, l-ebda prodott ma juri fl-elettroforeżi, iżda dan ma jfissirx li l-ebda prodott ma jkun amplifikat bil-PCR. B'mod ġenerali, referenza interna tista 'tintuża biex tiskopri cDNA. Jekk ir-referenza interna għandha riżultati, il-kwalità ta 'cDNA tista' tkun bażikament garantita (fi ftit każijiet, jekk il-framment tal-ġene fil-mira huwa twil wisq, jista 'jkun hemm eċċezzjonijiet).

2. Jekk hemm ġene magħruf amplifikat minn dan il-mudell, jista 'jiġi vverifikat mill-primers ta' dan il-ġene. L-amplifikazzjoni tar-referenza interna ma tfissirx neċessarjament li m'hemm l-ebda problema bis-cDNA. Minħabba li r-referenza interna għandha abbundanza kbira fis-cDNA, huwa faċli li tiġi amplifikata. Jekk cDNA huwa parzjalment degradat għal diversi raġunijiet, mill-perspettiva tal-probabbiltà, ir-riżultati tal-PCR ta 'ġeni fil-mira ta' abbundanza baxxa jiġu affettwati ħafna. Filwaqt li r-referenza interna għadha għolja fl-abbundanza, l-amplifikazzjoni probabbilment ma tiġix affettwata.

Iddegrada parzjalment tal-RNA. Sib l-integrità u ppurifika l-RNA

Il-kontenuti ta 'RNA ta' speċi differenti jistgħu jkunu differenti, iżda b'mod ġenerali, l-RNA totali estratt għandu jkun fih żewġ faxex ċari 28S u 18S f'elettroforeżi tal-ġell, u l-luminożità tal-faxxa ta 'qabel għandha tkun darbtejn ogħla minn dik ta' l-aħħar. Il-faxxa 5S tindika li l-RNA ġie degradat, u l-luminożità tiegħu hija proporzjonali għall-grad ta 'degradazzjoni. L-amplifikazzjoni b'suċċess tar-referenza interna ma tfissirx li m'hemm l-ebda problema bl-RNA, minħabba li r-referenza interna hija f'abbundanza kbira, l-RNA jista 'jiġi amplifikat sakemm id-degradazzjoni ma tkunx severa. L-OD₂₆₀/ OD₂₈₀proporzjon ta 'RNA pur imkejjel bi spettrofotometru għandu jkun bejn 1.9 u 2.1. Ammont żgħir ta 'impurità tal-proteina fl-RNA se jnaqqas il-proporzjon. Sakemm il-valur ma jkunx baxx wisq, RT ma jiġix affettwat. L-iktar importanti għall-RT hija l-integrità tal-RNA.

L-estensjoni tal-ġene intern ta 'referenza tista' tindika biss li RT irnexxa, iżda mhux neċessarjament relatat mal-kwalità tal-linja ta 'cDNA. Minħabba li l-frammenti ta 'referenza interni huma ġeneralment żgħar fid-daqs u għoljin fl-espressjoni, huma aktar faċli biex jirnexxu fit-traskrizzjoni inversa. Madankollu, id-daqs u l-espressjoni tal-ġene fil-mira jvarjaw minn ġene għal ġene. Il-kwalità ta 'cDNA ma tistax tiġi ġġudikata biss b'referenza interna speċjalment għall-frammenti fil-mira itwal minn 2 kb.

Xi kampjuni għandhom strutturi sekondarji kumplessi, jew għandhom kontenut rikk ta 'GC, jew huma prezzjużi b'abbundanza baxxa. F'dawn il-każijiet, reverse transcriptase xieraq għandu jintgħażel skond id-daqs tal-framment fil-mira u l-kampjun. Għal mudelli RNA b'kontenut għoli ta 'GC u struttura sekondarja kumplessa, huwa diffiċli li tiftaħ l-istruttura sekondarja f'temperatura baxxa, jew bi reverse transcriptase komuni. Għal dawn il-mudelli, Quant Reverse Transcriptase jista 'jintgħażel, peress li l-prestazzjoni tar-reverse transcription tagħha hija ovvjament aħjar minn dik tas-serje M-MLV reverse transcriptase, li tista' tirriversja diversi mudelli RNA b'mod effiċjenti u tittraskrivi RNA fl-ewwel linja ta 'cDNA sal-limitu massimu. Meta tuża kitt ġenerali tar-reverse transcriptase, sistema ta '20 μl tista' tirriversja b'mod effettiv biss 1 μg ta 'RNA totali. Jekk jogħġbok oqgħod attent għall-kapaċità massima RT tal-kit. Jekk il-mudell jiżdied b'eċċess, traskrizzjoni inversa tiffavorixxi l-RNA b'abbundanza kbira. Għalhekk, huwa aħjar li ma taqbiżx il-kapaċità massima tas-sistema.

A-1 Iddetermina jekk l-RNA huwiex degradat severament u jekk RT jirnexxix

B'mod ġenerali, ir-raġuni għan-nuqqas ta 'amplifikazzjoni ta' referenza interna ħafna drabi hija kkawżata minn degradazzjoni serja ta 'RNA. Raġuni oħra possibbli hija falliment tat-traskrizzjoni inversa. Referenza interna ma tistax tintuża bħala standard biex tiġġudika l-kwalità ta 'strand wieħed ta' cDNA, iżda tista 'tintuża bħala standard biex tiġġudika jekk it-traskrizzjoni inversa hix ta' suċċess jekk m'hemm l-ebda problema tal-kwalità ta 'l-RNA. L-iktar ħaġa importanti fil-proċess ta 'traskrizzjoni inversa hija li żżomm temperatura kostanti u sistema ta' reazzjoni kostanti sabiex ittejjeb l-effiċjenza tar-reazzjoni.

A-2 Iddetermina jekk il-primers għall-amplifikazzjoni tal-ġeni interni ta 'referenza humiex affidabbli u jekk hemmx xi problemi bir-reaġenti użati fil-PCR.

Għal kwantifikazzjoni relattiva, l-RNA għandu jkun ikkwantifikat qabel ir-reverse transcription, li hija meħtieġa wkoll f'ħafna kitts ta 'transcription b'lura, per eżempju, ikkwantifika l-input ta' RNA bħala 1 μg. Peress li s-cDNA traskritt bil-maqlub huwa soluzzjoni mħallta, inkluż RNA, oligo dT, enżima, dNTP, u anke ftit residwu ta 'DNA, se tkun ikkawżata devjazzjoni, u għalhekk huwa impossibbli li s-cDNA jiġi kkwantifikat b'mod preċiż. Għalhekk, il-kwantifikazzjoni tal-RNA hija meħtieġa. Meta wieħed iqis l-effiċjenza tat-traskrizzjoni inversa hija l-istess fost kampjuni differenti, l-ammont ta 'cDNA miksub għandu jkun l-istess, u l-analiżi kwantitattiva tista' turi l-paragun tal-livelli ta 'espressjoni ta' ġeni differenti fl-istess ammont ta 'RNA totali. Meta titwettaq PCR kwantitattiva ta 'fluworexxenza relattiva, cDNA kwantitattiv jista' ma jkunx meħtieġ wara traskrizzjoni inversa minħabba li l-ġene ta 'referenza intern jista' jaġixxi bħala referenza.

Huwa prinċipalment relatat mal-ġeni, u t-traskrizzjoni inversa ta 'framment twil mhix fattibbli għall-biċċa l-kbira tal-ġeni. L-ewwelnett, l-effiċjenza tat-traskrizzjoni inversa hija ferm inqas minn dik tal-PCR. It-tieni, ir-reġjun rikk tal-GC u l-istruttura sekondarja ta 'ħafna ġeni jirrestrinġu kemm ir-reverse transcription kif ukoll il-PCR. Fl-aħħarnett, il-fedeltà u l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tal-PCR huma diffiċli biex jiġu garantiti fl-istess ħin. Fil-proċess ta 'traskrizzjoni inversa, ħadd ma jista' jiggarantixxi li jikseb framment twil għal ġeni ta 'kopja baxxa, speċjalment bl-użu ta' oligo dT. Fir-rigward ta '5' UTR b'aktar GC, huwa saħansitra aktar diffiċli. Għalhekk, għadu metodu raġonevoli biex tirriversja t-traskrizzjoni bi primers każwali, issib is-siti tal-qsim naturali fil-framment fil-mira, amplifika bis-segmenti, u mbagħad twettaq ir-restrizzjoni diġestjoni u ligation. B'mod ġenerali, huwa diffiċli li jiġu amplifikati direttament frammenti akbar minn 2 kb, iżda mhux dejjem huwa impossibbli li tinkiseb: 1. L-ewwelnett, tiggarantixxi l-integrità ta 'RNA / mRNA, u l-estrazzjoni TRIZOL hija preferuta. 2. Il-kit RT-PCR M-MLV jista 'jintuża direttament. Estendi l-ħin ta 'l-ittemprar u żid in-numru taċ-ċiklu fil-proċess ta' amplifikazzjoni sewwa. Alternattivament, PCR imbejjed jista 'jiġi applikat, jew iwettaq reazzjoni waħda jew tnejn l-ewwel b'denaturazzjoni estiża kif suppost u ħin ta' estensjoni qabel amplifikazzjoni PCR normali, li tista 'tgħin biex testendi frammenti. Oqgħod attent għall-fedeltà tal-polimerasa. 3. Long Taq jista 'jintuża fil-PCR biex jinkisbu riżultati ideali. 4. Għal applikazzjoni ta 'espressjoni ta' proteina, għandha tiġi applikata polimerasa ta 'fedeltà għolja.

Hemm żewġ tipi ta 'reverse transcriptase offruti minn TIANGEN: Quant / King RTase u TIANScript M-MLV. Id-differenza ewlenija bejniethom hija l-ammont ta 'dħul ta' mudelli. Quant huwa reverse transcriptase uniku, li huwa differenti mill-M-MLV użat komunement derivat mill-virus tal-lewkimja tal-ġurdien Moloney. Quant huwa reverse transcriptase b'effiċjenza għolja espress b'mod rikombinanti mill-inġinerija ta 'Escherichia coli. Quant huwa adattat għall-amplifikazzjoni ta '50 ng-2 μg ta' RNA b'attività transcriptional inversa għolja u rendiment għoli. Meta mqabbel ma 'MMLV ordinarju jew AMV, l-akbar karatteristika ta' Quant hija li għandha affinità qawwija ħafna ma 'mudelli RNA u tista' treġġa 'lura mudelli kumplessi ta' traskrizzjoni mingħajr denaturazzjoni ta 'temperatura għolja. Għal mudelli b'kontenut GC ogħla, l-effiċjenza inversa hija ogħla. Madankollu, din ir-reverse transcriptase għandha attività RNase H, li tista 'taffettwa t-tul tal-prodott cDNA (adattat għal mudelli ta' <4.5 kb). Għal reverse transcription konvenzjonali, TIANScript MMLV reverse transcriptase huwa rakkomandat. Din l-RTase hija enzima modifikata b'attività RNase H dgħajfa ħafna, li hija adattata għal sinteżi twila (> 5 kb) ta 'cDNA.

Traskrizzjoni bil-maqlub b'pass wieħed u amplifikazzjoni tal-PCR jitlestew fl-istess tubu mingħajr ma tinfetaħ il-kopertura tat-tubu bejn is-sinteżi u l-amplifikazzjoni ta 'cDNA, li hija ta' għajnuna biex tnaqqas il-kontaminazzjoni. Peress li l-kampjuni kollha ta 'cDNA miksuba jintużaw għal amplifikazzjoni, is-sensittività hija ogħla, b'minimu ta' 0.01 pg ta 'RNA totali. Għal RTPCR ta 'pass wieħed b'suċċess, primers speċifiċi għall-ġene huma ġeneralment użati biex jibdew sinteżi ta' cDNA. Il-metodu f'żewġ stadji, jiġifieri traskrizzjoni inversa u amplifikazzjoni tal-PCR jitwettaq f'żewġ stadji. L-ewwelnett traskrizzjoni inversa titwettaq minn mudell ta 'RNA biex jinkiseb cDNA, u s-cDNA miksub huwa soġġett għal reazzjoni waħda jew aktar ta' PCR differenti. Il-metodu f'żewġ stadji jista 'juża oligo (dT) jew primers każwali biex jiggwida s-sinteżi tal-ewwel linja ta' cDNA, u jista 'jittraskrivi bil-maqlub l-informazzjoni kollha tal-mRNA minn kampjun speċifiku.